» Получаване на водород от винаса(Дипломна работа)

[Mozo]

ХИМИКОТЕХНОЛОГИЧЕН И МЕТАЛУРГИЧЕН УНИВЕРСИТЕТ

ФХСИ
КАТЕДРА ”БИОТЕХНОЛОГИЯ”











НА ТЕМА:
"ПОЛУЧАВАНЕ НА ВОДОРОД ОТ ВИНАСА"






Изготвил:
Яна Григорова Григорова
Научен ръководител:
проф. дбн М. Кръстева



София, 2003 г.











Ние сме свидетели на това, как се превъплъщават в живота много надежди на човечеството, които дълго време изглеждаха неосъществими. Реални очертания приема “храната на боговете”, преведена в наше време на строгия език на химията и биологията.

Акад. М. Х. Чайлахян









Изказвам най – сърдечна благодарност на научния си ръководител проф. дбн М. Кръстева за оказаната ми помощ при разработването на настоящата дипломна работа и на консултанта ми ас. И. Лалов.









С Ъ Д Ъ Р Ж А Н И Е


Въведение..........................................................5 стр.
Литературен обзор............................................7 стр.
1. Фотосинтетични системи за генериране на водород....8 стр.
2. Хетеротрофни системи за продуциране на водород...12 стр.
Цел и задачи.....................................................21 стр.
Използвани методи и материали....................22 стр.
Резултати..........................................................31 стр.
Дискусия...........................................................39 стр.
Изводи...........................................................42 стр.
Използвана литература................................43 стр.







В Ъ В Е Д Е Н И Е

През XXI век консумацията на енергия расте драстично и използването ъ е небалансирано. Съвременната енергетика се състои от 95 – 98 % енергия от горива (нефт, въглища, природен газ), от 1 – 4 % атомна енергия и минимален процент се заема от алтернативни източници на енергия (слънчева, хидро, биомаса и т. н.). Ето защо бързото развитие на съвременното общество изисква паралелно повишаване на производство на енергия.
Енергийните ресурси и начините на тяхното използване водят до непрекъснато растящо замърсяване на планетата, което застрашава човечеството с по – бързи темпове от енергийния глад.
Биотехнологията и нейното ново направление биоенергетиката, търсят нови лесно възстановяеми, екологично чисти и евтини източници на енергия.
Биомасата като източник на енергия е обект на голямо внимание от страна на изследователите. Пресечна точка на търсенията по изложените по – горе проблеми – екологичния и енергийния е възможността биомасата да се трансформира до гориво, като в същото време се пречистват. За да бъде използвана икономически изгодно биомасата трябва да се оценява. Тя е от различен произход: отпадъци от бита, промишлеността, селското стопанство, от производството на багрила, нефтени отпадъци, отпадъци от производството на вино и високоалкохолни напитки.
Методите за трансформацията на биомасата са много и различни: директно изгаряне, пиролиза, алкохолна ферментация, анаеробна ферментация.
Традиционните методи за производство на вино и високоалкохолно напитки продуцират отпадъци, които в последно време са в големи количества. Тези отпадъци са богати на органични киселини, захари, багрила и др., поради което са те са добър субстрат за получаване на водород.
Въпреки, че все още е недостъпен за масовия потребител, водородът представлява може би най – голямата алтернатива като гориво на бъдещето. Това е причина за осъществяването на толкова много интензивни изследвания, в резултат на които са разработени редица биологични системи за генериране на водород.


















ЛИТЕРАТУРЕН ОБЗОР

Водородът е един от главните компоненти на живите организми. Спектроскопски е установено наличието на водород в Слънцето и много други звезди. Днес се приема, че 92 мол. % от веществата във Вселената са изградени с участието на водород.
Съществуват много методи за получаване на водород: реформинг на въглеводороди, газификация на въглища, редукция на вода при използване на въглероден оксид, електролиза на вода, от метални съединения.
Все по – голямо значение придобиват биологичните методи за получаване на водород, защото той е едно от най – перспективните горива (гориво на бъдещето), тъй като при изгарянето си не дава вредни продукти, а само вода.
Докато биометанизацията е процес, който е технологично добре разработен, биологичните системи за генериране на водород все още се намират на етапа на лабораторни изследвания, макар да са достигнали границата на създаване на реална индустриална технология.
Биологичните системи за генериране на водород най – общо могат да се разделят на фотосинтетични, т.е. използващи енергията на слънчевата светлина и биохимични, т.е. използващи енергия получена при биохимичното трансформиране на органични съединения. Към първите спадат комбинираните безклетъчни биологични системи и системите използващи фотосинтетични микроорганизми. Вторите включват системите с ферментационни микроорганизми и ензимни системи.



Фотосинтетични системи за генериране на водород

За осъществяване на процеса на генериране на биоводород като енергиен източник, тези системи използват слънчевата светлина. Към тях спадат както безклетъчни системи, съставени от отделни компоненти с биологичен или не биологичен произход, така и такива основаващи се на използването на цели организми като цианобактерии, зелени водорасли, пурпурни бактерии и др. При тях генерирането на водород е свързано с биофотолиза на водата или в други случаи (пурпурни бактерии) с фотобиохимична трансформация на различни органични съединения.

Комбинирани безклетъчни системи за продуциране на водород

Решително за проучванията в областта на възобновяемите източници на енергия се оказало откритието, че ако се съчетаят хлоропласти с подходящи преносители на електрони и ензими с хидрогеназна активност, то под действието на светлина протича процес на разлагане на водата до водород и кислород наречен фотолиза. Това е първата стъпка в развитието на биологичните енергийни системи, които превръщат слънчевата енергия в гориво – водород.
Получаването на водород с помощта на хлоропласти за първи път е демонстрирано в началото на 60 – те години, когато е бил получен водород от система съдържаща изолирани от спанак хлоропласти, изкуствени електронни донори вместо вода и бактериални екстракти, съдържащи хидрогеназа [1]. Общата схема на реакцията е представена на фиг. 1.





Фиг. 1 Получаване на биоводород в безклетъчна фотосинтетична система


По – късно Beneman et al. докладват за създаването на хлоропласт – фередоксин – хидрогеназна система за продуциране на водород вследствие на директна фотолиза на водата [2]. По – нататък усилията на изследователите се насочват към удължаване на време-живота на безклетъчните системи за фотопродукция на биоводород посредством стабилизиране на отделните им компоненти. Най – неустойчивият компонент на тези системи безспорно са изолираните от естествената си природна среда хлоропласти. Затова редица изследвания били насочени най – вече към тяхното стабилизиране предимно посредством включването им в различни полимерни матрици с природен [3, 4] или синтетичен [5] произход. Друг компонент подлаган на стабилизация е ензима хидрогеназа като това се осъществявало или посредством имобилизацията му, или посредством запазване на естествената му среда т.е. използване на цели микроорганизми с хидрогеназна активност [6], или посредством заменянето му със синтетични аналози [7]. Поради непреодолимите недостатъци на безклетъчните системи за генериране на биоводород вниманието на изследователите се насочва към създаването на системи за фотогенериране на биоводород на базата на цели микроорганизми.




Фотогенериране на водород с помощта на цели организми

Една от привлекателните възможности пред технологиите на слънчевата енергетика се оказало използването на цели микроорганизми, осъществяващи фотобиологично продуциране на водород от вода за сметка на слънчевата енергия. Както цианобактериите така и зелените водорасли притежават две фотосистеми аналогични на тези при зелените растения и са способни да образуват водород и кислород по пътя на пряката фотолиза на водата. При цианобактериите като Anabaena cylindria отделянето на водород се извършва посредством съчетаването на два процеса, протичащи в два различни типа клетки. Във вегетативните клетки на водораслите протича фотосинтеза съпроводена с отделяне на кислород и образуване на въглехидрати. В хетероцистите представляващи диференцирани клетки при недостиг на азот протича процес на отделяне на водород от въглехидратите като странична реакция, катализирана от намиращия се в тях ензим нитрогеназа. Основната роля на този ензим се състои в катализирането на редукцията на атмосферния азот до амоняк (т. нар. азотфиксация). Другата група фотосинтетични микроорганизми подходящи за създаване на системи генериращи биоводород са пурпурните бактерии. Те отделят молекулярен водород също с помощта на нитрогеназа в условията на азотен глад като за целта използват енергията на видимата светлина и редуцирани органични съединения.
Една от първите системи за фототрофно генериране на биоводород с помощта на цианобактерии е предложена от Beneman и Weare през 1974 г. Те установили, че активно растящи култури от Anabaena cylindria са способни при осветяване да отделят водород и кислород вследствие на директна фотолиза на водата [8]. По – късно редица автори изследват условията, при които този микроорганизъм продуцира водород като успяват да ги оптимизират както по отношение на продължителността, достигаща един месец така и по отношение на количеството на продуцирания газ [9]. Стабилизацията на фотобиологичните системи за продуциране на водород се осъществява както посредством включването им в различни носители така и посредством генноинженерни манипулации на микроорганизмите. Теоретически посредством този метод може да се постигне 10 – 13 % конверсия на слънчевата енергия в химическа.
Във връзка с преодоляването на кислородната непоносимост интересни резултати са били постигнати като от щамове бактерии с Н2 – отделящи ензимни системи по – толерантни към кислорода от тези при повечето микроорганизми е бил изолиран генетичен материал, който въведе щам на водораслото Chlamydomonas притежаващо О2 – отделяща ензимна система като по този начин са създадени нови щамове водорасли, продуциращи едновременно Н2 и О2 [10]. Проведени са изследвания, целящи повишаване ефективността на превръщане на слънчевата светлина като посредством генетична манипулация на Chlamydomonas в него е въведена ензимна система насочваща потока от електрони от фотосинтезата към продуциране на Н2, а не към синтез на въглехидрати,което е довело до повишаване ефективността на превръщане слънчевата енергия от 10 до 20 % [10].
Както бе отбелязано по – горе пурпурните бактерии са способни да превръщат слънчевата енергия във водород като използват редуцирани съединения в ролята на субстрат. Известни са редица системи създадени за фотопродукция на водород с пурпурни бактерии като в ролята на субстрат са използвани различни органични съединения като лактат, сукцинат, пируват и др. или в някои случаи органични отпадъци. Един от най – добре изучените микроорганизми от този тип са бактериите от род Rhodobacter. Интересна система за продуциране на водород с помощта на имобилизирани в полиуретанова пяна клетки от този микроорганизъм е предложена от Fedorov et al. Авторите са успели да осъществят непрекъснат процес на получаване на водород със скорост 21 ml/h за литър носител с ефективност на превръщане на млечната киселина до водород 86%. За времето на протичане (35 дни) процеса не бе повлиян от никакви лимитиращи фактори [11].


Хетеротрофни системи за продуциране на водород


Към системите за генериране на водород спадат както тези основаващи се на ензимни трансформации на органични съединения в безклетъчни системи, така и базиращи се на специфичния метаболизъм на някои бактериални видове.




Ензимни системи за продуциране на биоводород


С развитието на останалите биологични системи нараства интереса и към развитието на ензимни системи за продуциране на водород. Принципът им на работа се състои в ензимно превръщане на захарите във водород. Според авторите изследващи тези системи подобен подход би могъл да се окаже обещаваща алтернатива при генерирането на енергийни носители. Разработени са подобни лабораторни системи за получаване на водород от глюкоза или захароза[12]. Принципът на действие на подобна система използваща като изходен субстрат глюкоза е демонстриран на фиг.2

Фиг. 2 Схема на ензимно продуциране на водород от глюкоза



Микробиологични и биохимични принципи на хетеротрофното генериране на биоводород

При нефотосинтезиращите водород – продуциращи бактерии, отделянето на молекулярен водород се извършва при процеси на ферментация (безкислородно разграждане) на органични съединения, обикновено въглехидрати. Отделянето на водород е процес, типичен за масленокиселата ферментация, осъществявана от микроорганизми от род Clostridiа. Tой се наблюдава също при ацетон – бутиловата и смесената ферментация (E. coli, Enterobacter, Klebsiella), както и при водородната ферментация на целулоза (Cl. cellobioparum). Общият вид на биохимичните трансформации, протичащи в резултат на различните ферментации може да се представи с помощта на следните уравнения [13]:


Масленокисела ферментация


C6H12O6 CH3CH2CH2COOH + 2CO2 + 2H2 + 84 kJ


Aцетон - бутилова ферментация




Смесена ферментация





Водородна ферментация на целулозата




Най – широко приложение при разработването на хетеротрофни системи за продуциране на биоводород намират микроорганизмите, осъществяващи ферментации от масленокисел или смесен тип.


Масленокисела ферментация

Масленокиселата ферментация (МКФ) представлява процес на анаеробно разграждане на въглехидрати, при което се получават главно маслена и оцетна киселини, въглероден диоксид и водород. При определени условия се отделят етилов, пропилов и бутилов алкохоли, ацетон, ацетоин и др. Масленокиселата ферментация протича там, където има органично вещество без достъп на въздух. Тя протича на дъното на водоемите, при пречистване на отпадни води и при получаване на биогаз.
Масленокиселата ферментация се причинява от широко разпространени в природата микроорганизми. Те могат да се изолират от почва, оборски тор, замърсени води, храносмилателния тракт на хора и животни и т.н. Клетките на масленокиселите бактерии представляват прави или слабо извити пръчки с различна големина. Всички са спорообразуващи и грамположителни, макар че в някои стари култури могат да се открият и грамотрицателни [14]. Към масленокиселите бактерии се отнасят много видове предимно от род Clostridiа. Най – често използваният в биологичните системи за генериране на водород микроорганизми от този тип се отнасят към вида Clostridium butyricum. Този вид е широко разпространен в почвата. Бактериите му имат пръчковидни форми с различни размери. Клетките са снабдени с камшичета, с помощта на които се движат. Дължината им варира от 0,75 – 10 µm. Срещат се единично или във вериги. Спорите се разполагат в средата на клетките, в следствие на което се издуват като вретено, от където идва и названието им (claustrum - вретено). Clostridium butyricum предизвиква ферментационно разпадане на глюкоза, лактоза, скорбяла, ксилоза, млечна киселина и глицерин като образуват маслена и оцетна киселина с отделяне на газ (CO2 и H2).
Биохимичната същност на масленокиселата ферментация е установена от Луи Пастьор през 1861г. Както бе отбелязано по – горе, в обобщен вид биохимичните трансформации, протичащи при този процес могат да се представят със следното уравнение:





До образуването на пируват масленокиселата ферментация протича по метаболитния път на гликолизата известен като Ембден – Майерхоф – Парнас. По нататък пируватът се декарбоксилира, при което се образува ацеталдехид, преминаващ в резултат на алдолна кондензация в алдехид на b-оксимаслената киселина (CH3CHOHCH2CHO), който от своя страна се превръща в маслена киселина. Тези биохимични трансформации могат да бъдат описани с помощта на следните уравнения:












Смесена ферментация

Смесеният тип ферментация е биохимичен процес, при който въглехидратите се разграждат до млечна, оцетна, янтърна, мравчена киселини, етанол и газовете въглероден диоксид и водород. Тази ферментация протича значително по – сложно от типичната масленокисела ферментация поради по – сложната ъ ензимна система, която притежават причинителите ъ. Представителите на микроорганизмите причиняващи фермрнтация от смесен тип се отнасят към семейство Enterobacteriaceae с родовете Escherichia, Citrobacter, Klebsiella и Enterobacter. Всички те са грамотрицателни, аспорогенни факултативни анаероби, които при разграждане на глюкоза образуват киселини. Общото уравнение на смесената ферментация се изразява по следния начин:







Процесът на получаване на водорода се катализира от хидрогеназа с участието на редуциран фередоксин.
Фосфокластичното усвояване на пирувата е изучено най-добре при род Clostridium. Механизмът му може да бъде демонстриран посредством схемата представена на фиг. 3.






Фиг.3 Механизъм на фосфокластичното усвояване на пируват


За разлика от клостридиите, при колибактериите в някои случаи вместо въглероден диоксид и водород се получава мравчена киселина.



Съвременни тендеции в разработването на хетеротрофни системи за генериране на биоводород от цели микроорганизми

Както бе отбелязано по – горе, известни са редица бактерии като например Escherichia coli, Enterobacter aerogenes, Clostridium butyricum, Clostridium acetobutyricum. Clostridium perfringens и др., които са способни активно да продуцират биоводород от захари в анаеробни условия. Известна е също така и способността на някои цианобактерии и водорасли да осъществяват аналогични процеси. На базата на такива микроорганизми са създадени различни типове лабораторни системи за продуциране на биоводород, от различни субстрати. Най – ефективен при продуцирането на водород посредством ферментация на глюкоза са се оказали представителите на вида Clostridium butyricum. За някои от тях се съобщава, че произвеждат 35 mmol/h водород от 1 g глюкоза при 37? С. По тази причина те са най – често използваните микроорганизми при конструирането на биологични системи за хетеротрофно генериране на биоводород [15]. Изследвани са и възможностите на други видове микроорганизми като Escherichia coli [16] и Enterobacter aerogenes [17] и др., чието предимство се състои във факта, че за разлика от представителите на род Clostridiа те са факултативни анаероби и не изискват стриктно спазване на анаеробни условия при развитието си. Те са способни при наличието на достатъчно субстрат сами да създават анаеробни условия в изолирани от атмосферния въздух системи. Всички изследвани микроорганизми са били стабилизирани посредством включването им в различни гелове. Обикновено водород – продуциращите бактерии използват като субстрат и енергиен източник глюкоза. Някои изследвания са демонстрирали възможностите за използване в качеството си на субстрат на органично натоварени води, отпадащи от хранително – вкусовата промишленост [16]. Демонстрирана е и възможността като субстрат за получаване на биоводород да бъдат използвани целулозни материали, подлагани на ферментация с помощта на микроорганизми от вида Clostridium sp. [18].
Интересни резултати по отношение подобряване на стабилността и ефективността на този тип биосистеми за генериране на водород са получени при използването на факултативните анаероби от вида Enterobacter aerogenes, която расте добре при анаеробни условия, консумирайки кислорода като след изчерпването му започва анаеробно продуциране на биоводород и други метаболити от глюкоза. В конструираната от Tansho et al. система директно в културалната течност са потопени електродите на горивна клетка, която трансформира с висока ефективност водорода и другите електроактивни метаболитни продукти в електрическа енергия. Осъщественият полунепрекъснат процес, при който субстрата се подава периодично демонстрирал висока устойчивост за продължителен период от време [17]. По – нататъшното подобрение както на ефективността така и на стабилността на биосистемите за хетеротрофно продуциране на водород е постигнато при разработките, съчетаващи качествата на два вида микроорганизми единият, от които е отличаващия се с висока биохимична ефективност Clostridium butyricum, а другия е факултативен анаероб, например Enterobacter aerogenes, осигуряващ съхраняването на стриктни анаеробни условия в средата без използването на допълнителни средства за целта [19].
Интересна възможност за биологична продукция “на тъмно” на водород предлага установения при някои видове цианобактерии уникален тип водород – продуцираща активност. Установени са около 400 щама, които могат да използват въглероден оксид и вода за да продуцират водород и въглероден диоксид с достатъчно високи скорости. Двадесет и пет от тези щамове са били изучени по – детайлно като е установено за всички тях, че оползотворяват почти 100 % от въглеродния оксид за продукция на биоводород [10].
В катедра Биотехнология беше разработен метод за непрекъснато получаване на водород с имоболизиран Clostridium butyricum и с използване на винаса, в резултат на което бяха получени много добри резултати [20].




ЦЕЛ И ЗАДАЧИ


Целта на настоящата дипломна работа е да се получи водород от винаса, от която са отстранени органичните киселини като се оползотворяват само съдържащите се в нея захари. В изпълнение на тази задача си поставихме следните по – конкретни задачи:

? Култивиране на Clostridium butyricum върху тиогликолатна среда.

? Характеристика на винаса по отношение на съдържание на захари и органични киселини.

? Отстраняване на съдържащите се във винасата органични киселини с помощта на йонообменна смола.

? Организиране на ферментационен процес със свободна биомаса на Clostridium butyricum, събиране и анализ на получените газове.








ИЗПОЛЗВАНИ МЕТОДИ И МАТЕРИАЛИ


Материали и апарати


? Щам продуцент

В настоящата дипломна работа, като биологична единица за генериране на биоводород беше използвана микробиологична култура Clostridium butyricum.


? Хранителна среда за култивиране


Тиогликолатна среда беше закупена от Национален център по заразни и паразитни болести, предназначена за лабораторно култивиране на анаеробни и аеробни микроорганизми и за контрол на стерилност.

Състав ( g/l ):


Казеинов хидролизат ферментативен -0 15,0
L-цистин -1 0,5
Декстроза -2 5,0
Дрождев екстракт -3 5,0
Натриев хлорид -4 2,5
Натриев тиогликолат -5 0,5
Резазурим -6 0,001
Агар – агар -7 0,75
pH -8 7,1 + 0,2



? Винаса

Отпадъците от винопроизводството могат да се разделят на три основни групи:
? твърди отпадъци, неподдаващи се на вторична алкохолна ферментация – чепки и семки;
? твърди отпадъци, поддаващи се на вторична алкохолна ферментация – ципи и тънкостенни клетъчни прегради;
? течен отпадък – винаса, получена след дестилация на вина и при производството на винен дестилат за брендита и ракии.


? Йонообменна хроматография

При провеждането на експериментите беше използвана анионообменна смола IRA – 400 за премахване на органичните киселини като се оползотворяват само захарите съдържащи се във винасата.


? Апарати

При провеждане на експериментите и необходимите измервания бяха използвани следните апарати:
- Термостат бактериологичен ТБ 50
- Апарат на Кох – лабораторен
- Центрофуга
- Микроскоп
- Аналитична везна – Mettler AE 100
- Спектрофотометър – SPEKOL 11
- рН – метър – Radelkis OP – 2H/1
- Магнитна бъркалка
- Водороден сензор


? Методи

Анаеробно култивиране на Clostridium butyricum

? Стерилизация на епруветки при t = 180? C за 1,5 h в сушилня;
? Приготвяне на хранителна среда – тиогликолатната хранителна среда се разтваря на водна баня (към твърдата хранителна среда се прибавя 2 % агар). Стерилизира се в автоклав и се разсипва в епруветки. За целта 2.95 g от използваната хранителна среда и добавеното количество агар – агар, бяха разтворени в 100 ml дистилирана вода чрез нагряване до кипене. Полегатият агар беше получен чрез разливане на гореща хранителна среда в пет стерилни епруветки снабдени с микробиологични тапи;

? Препосявка на изходната култура Clostridium butyricum с помощта на микробиологично йозе – за създаване на анаеробна среда, епруветките бяха снабдени с пирогалол и натриева основа отделени от полегатия агар със стерилен памук. Микробиологичните тапи бяха заменени с каучукови;
? Култивирането на Clostridium butyricum на полегат агар и в течна хранителна среда беше извършено в микробиологичен термостат при 37? С за 24 h;
? При култивиране на Clostridium butyricum на хранителна среда винаса, анаеробната среда се постигаше чрез продухване с инертен газ аргон. За целта се използваше лабораторен реактор снабден с барбутиращо устройство свързано с източника на аргон.


Обезцветяване на винаса

За целта се използва активен въглен на прах с висока специфична повърхност, като за 1 литър винаса са необходими 50 g активен въглен.

Ход на обезцветяването:
1 литър винаса се нагрява до 50? C и на порция с продължаване на нагряването се прибавя въглена при добро разбъркване. След кипене от 3 до 5 минути, нагряването се спира и суспензията се оставя да изтине и утаи. Супернатантата се отделя чрез филтруване и представлява светложълтеникава бистра течност. Тя е лишена от всички червени багрила и от малък процент азотни вещества. Киселинността не се променя.



3. Аналитични методи

Определяне съдържанието на редуциращи вещества с помоща на DNS – метод

Определянето се основава на окислението в алкална среда на карбонилната група във въглехидратите от 3,5 – динитросалицилова киселина (DNS), при което нитрогрупата в DNS се превръща в амино група, което е съпроводено с промяна на цвета от жълт към оранжевочервен. Образуващата се при реакцията динитросалицилова киселина се определя колориметрично.
За прилагане на този количествен метод бяха приготвени стандартен разтвор на глюкоза (1,0 mg/ml), разтвор на 3,5 – динитросалициловата киселина, 5 % воден разтвор на формамид и 2,3 N разтвор на натриева основа. С помощта на тези реактиви беше построена калибровъчна графична зависимост, като в серия от епруветки бяха внесени 0,1; 0,2; 0,3; 0,4 и т.н. ml. от стандартния глюкозен разтвор и чрез прибавяне на дестилирана вода обемът на разтворите беше доведен до 1,0 ml. Към епруветките бяха прибавени по 1,0 ml. от 5% разтвор на формамид и по 1,0 ml. от 2,3 N разтвор на натриева основа. След 30 min. престояване, към всяка една епруветка беше добавено по 2,0 ml. от разтвора на DNS.
След нагряване на кипяща водна баня за време 5,0 min. и охлаждане на разтворите, към тях бяха прибавени по 5.0 ml дестилирана вода. Пробите бяха спектрофотометрирани при l = 545 nm, срещу контролна проба съдържаща 1,0 ml дестилирана вода, вместо глюкозен разтвор. От получените стойности беше построена стандартна права.
По DNS метода бяха определени съдържанието на редуциращи вещества в проби от обезцветени винаси и проби от супернатанта на културални течности. Стандартната права е показана на фиг. 4.





Фиг. 4 Стандартна права за определяне на редуциращи вещества с помощта на DNS – метода


Анализи на клетъчна биомаса

Количеството на свободните клетки от Clostridium butyricum беше определяно като абсолютно сухо вещество. Бактериалната биомаса бе промита и отделена чрез центрофугиране при 3000 об/мин. за 20 min. и отново ресуспендирана в дестилирана вода до първоначалния обем на културалната течност. Получената клетъчна суспензия се използва за построяване на стандартна права за определяне концентрацията на клетки. За целта се правят подходящи разреждания, които се спектрофотометрират при l = 600 nm. От различните разреждания на клетъчната суспензия се взимат проби от по 1,0 ml за определяне на сухо тегло. Това определяне бе извършвано като пробите бяха поставяни в предварително темперирани тегловни шишенца и сушени до постоянно тегло при 103 – 105о С. Стандартната права е показана на фиг. 5.













Фиг. 5 Стандартна права за определяне количеството на микробни клетки от Clostridium butyricum


Определяне на рН

За определяне на pH на средата върху процесите за получаване на водород с помощта на Clostridium butyricum беше използван рН – метър Radelkis OP – 2H/1. Този апарат беше използван и за всички останали случаи на измерване или коригиране на рН на средата.



Определяне на обща (титруема) киселинност чрез потенциометрично титруване

Методът се основава на титруването на опреден обем винаса с натриева основа до неутрална реакция установен с помощта на рН – метър.

Ход на анализа: титруването се осъществява с помоща на рН – метър с комбиниран стъклен електрод. В стъклена чаша се поставят 20 ml винаса, ако е необходимо за осигуряване на пълното потапяне на електрода се добавят около 20 ml дистилирана вода. Електродът се потапя в течността и титруването се провежда при интензивно разбъркване до установяване на рН = 7.00. Продължителността на титруването трябва да е от 3 до 5 min. Методът позволява да се определя и началното рН на винасата.

Небходими реактиви: те са 0,1 N натриева основа и проба от винаса

Изчисления: титруемата киселина се изчислява в g/l, като винената киселина по формулата x = V . 0,0075 . 1000/20 = 0,375 . V, където V е обемът еквивалентен на 0,1 N натриева основа изразходван за титруване на пробата в ml.
- 0,0075 е количеството винена киселина в грамове отговарящо на 1 ml 0,1 N натриева основа.
- 1000 е коефициент за преизчисляване на резултата за 1l.
- 20 е обем на пробата от винаса в ml.



Детекция на водорода с водороден сензор

Принцип на действие:
Повърхностното съпротивление на синтерован полупроводник от SnO2 зависи от адсорбирания върху него водород.
Сензорът TGS 800 на фирма FIGARO ENGINEERING Ing е основан на този принцип. Той се състои от тръбичка от синтерован SnO2, в която е поместена нагревателна нишка от хромна сплав с диаметър – 0,08 mm и електрическо съпротивление – 38 ? ± 3 ? при 25є C. Мощността на нагревателя е 650 mW при захранващо напрежение 5 V. Взети са специални мерки водорода да не се запали от нагряването. Нагревателната жичка служи да ускори десорбцията на вече адсорбирания водород върху повърхността на синтерования SnO2. Моментната концентрация на адсорбирания върху SnO2 водород е равновесна величина и нагряването изтегля равновесието в посока на десорбцията. С това се намалява времето на реакция на сензора при измерване на намаляващата концентрация на водорода.










Р Е З У Л Т А Т И


Култивиране и характеристика на Clostridium butyricum

Clostridium butyricum беше култивиран в предварително стерилизирана тиогликолатна хранителна среда. Анаеробната среда беше постигната с помоща на пирогалол и натриева основа. Така получените епруветки с Clostridium butyricum по – нататък се използваха като изходен материал за провеждане на лабораторни изледвания за получаване на водород.
Концентрацията на клетките на Clostridium butyricum беше определена с помоща на стандартна права, отчитаща концентрацията на сухи клетки. Чрез изменение адсорбцията на културалната среда при ? = 600 nm. Стандартната права е показана на фиг. 5.

Развитието на Clostridiun butyricum беше проследено като първоначално се наблюдаваше наличие на лаг фаза, последвано от експоненциално нарастване на биомасата в резултат на делене на клетките. След експоненциалната фаза беше проследено стациониране на процеса. И в двата експеримента на настоящата дипломна работа бяха осъществени с биомаса, съхранявана в хладилника при t = 4є C. На всеки две седмици микробиалната култура бе препосявана върху полегат агар.


Основни характеристики на винасата като субстрат

Винасата отпада в процеса на дестилация след отделянето на алкохола при производството на винен дестилат за бренди и ракии.
Количеството ъ зависи изключително от количеството на виното, предназначено за дестилация, както и от метода за дестилиране.
Винасата съдържа множество захари, органични киселини, естери, азотни вещества, полифеноли – танин и пигменти (флавони за белите и антоциани за червените). Фенолните съединения във винасата са представени главно от багрилни вещества – антоциани (червени), флавони (жълти), левкоантоциани и някои киселини. Тези вещества имат голямо значение за винарството, но за нас те не представляват интерес, дори в някои публикации се твърди, че имат антибактериален ефект. Могат да се извлекат с активен въглен. Всички тези съставки при сегашната технология на оползотворяване остават във винасата и водят до силно замърсяване на водите.
След обезцветяване винасата беше подложена на деацидификация. Органичните киселини бяха извлечени от винасат с помощта на анионообменна смола IRA – 400. За целта към 100 ml винаса бяха добавени 40 g йонообменна смола.
Анионообменната смола предватилно беше промита с дестилирана вода до неутрална реакция.
Процесът беше проведен в продължение на осем часа при постоянно разбъркване и стайна температура, при което непрекъснато беше следено pH на реакционната смес. Стойността на pH при обезцветената винаса в хода на процеса нарастна от 4,2 до 7,0.
Определянето на редуциращи вещества, преизчислени като глюкоза беше осъществено с DNS – метод. За отчитане концентрацията на редуциращи вещества беше построена стандартна права като за еталон беше използван стандартен разтвор на глюкоза. Стандртната права е показана на фиг. 4.
Общата (титруема) киселинност беше определена чрез потенциометрично титруване с натриева основа до неутрална реакция установена с помощта на pH метър. Параметърът титруема киселинност беше изчислен като еквивалентна концентрация на винена киселина съгласно формулата демонстрирана в раздела “Методи и материали” .
Резултатите са представени на табл. 1.



Редуциращи вещества, g/l Обща (титруема) киселинност, g/l
8,7 1,66


Табл. 1 Съдържание на редуциращи вещества и обща киселинност на обезцветена винаса

Получаване на водород от винаса несъдържаща органични киселини със свободна култура от Clostridium butyricum


Процесът на получаване на биоводород посредством масленокисела ферментация на деацидифицирана винаса бе изследван с помощта на лабораторна установка показана на фиг. 6.




Фиг. 6 Принципна схема на лабораторна уредба

1 – бутилка с аргон;
2 – бактериален филтър;
3 – анаеробен биореактор;
4 – разбъркващо устройство;
5 – абсорбер на CO2;
6 – газхолдер


В стъклен реактор с обем 125 ml бяха внесени 90 ml винаса и 10 ml инокулат. Реакторът осигуряваше периодично или непрекъснато въвеждане на субстрат, продухване на работния обем с инертна атмосфера и отделяне на генерирания газ. Стерилността на инертната аргонова атмосфера се гарантираше от бактериален филтър запълнен с активен въглен и памук.
Между реактора и газхолдера беше поставен съд за поглъщане на въглероден диоксид с калциев дихидрооксид.

Експериментите бяха проведени при непрекъснато разбъркване и стайна температура (t = 23є C).
Продухването с аргон беше с цел създаване на анаеробна атмосфер в реактора и се извършваше в продължение на 20 – 30 минути. По време на процеса през определен период беше контролирано pH на средата и следните параметри на процеса: нарастване на микробната биомаса и намаляване на количеството на редуциращите вещества.

Периодичен процес за получаване на водород:

Процесът протича при стайна температура (t = 23?C) и без допълнително внасяне на винаса.

Общата продължителност на процеса беше 150 часа като след първоначалната лаг фаза, продължила 24 часа започна отделяне на биоводород. В края на процеса количеството на получения водород беше 240 ml общо или се осъществяваше със средна скорост 1,6 ml/h. В течение на процеса биомасата нарастна от 42,5 mg до 155 mg. На фиг. 7 е показан хода на процеса свързан с отделяне на биоводород и нарстване на биомасата.
Съдържанието на захари във винаса беше изменено от 8,7 g/l до почти пълно изразходване на захарите – 0,06 g/l. Намаляване количеството на захарите е прсдставено на фиг. 8.
Стойността на pH на средата бе контролирано периодично като се поддържаше в границите от 7,0 до 6,0.







Фиг. 7 Кинетика на получаване на биоводород и нарастване на биомасата






Фиг. 8 Намаляване количеството на редуциращи вещества



Полунепрекъснат процес за получаване на водород:

Процесът протича при t = 23?C и с допълнително внасяне на винаса.

В хода на този експеримент към 10 ml културална суспензия бяха добавени 90 ml деацедифицирана винаса, при това количество на отделния водород 180 ml за 70 часа (2 ml/ml винаса) или 2,57 ml/h. След седемдесетият час бяха добавени 15 ml винаса и от реактора бяха отстранени съответно 15 ml културална течност. В резултат на това продукцията на биоводород бе възобновена като общият газов обем достигна 210 ml до деветдесет и шестия час. Продуцирането на биоводород се осъшествяваше със средна скорост 2,19 m/h.
Микробната биомаса нарастна от 61 mg до 37 mg. На фиг. 9 е представен процесът на нарастване на биомасата и увеличаване количеството на биоводород.
Съдържанието на захари във винасата се изменяше от 8,7 g/l до почти пълно изразходване на седемдесетия час. След добавянето на ново количество винаса, съдържанието на редуциращи вещества се увеличи, като новото количество захари се изконсумира напълно през следващите двадесет и шест часа до края на процеса. Изменението количеството на захарите е представено на фиг. 10.
Стойността на pH се контролираше в границите от 7,0 до 6,0.












Фиг. 9 Кинетика на получаване на биоводород и нарастване на биомасата




Фиг. 10 Изменение количеството на редуциращите вещества


Д И С К У С И Я

Clostridium butyricum е бактерия, за която е известно, че при анаеробни условия и в присъствието на подходящ субстрат може да продуцира молекулен водород. При идеални условия на биохимична конверсия от 1 mol глюкоза могат да се получат 4 mol водород, което превръщане се извършва посредством мултиензимните системи на бактериите.
Както показват последните изседвания, водородът се очертава като гориво на бъдещето, поради това че при неговото изгаряне не се получават вредни емисии, а само вода.
Изследванията в катедра “Биотехнология” за получаване на водород с помощта на бактерии (от род Clostridia) са започнали преди две години с използване на различни субстрати, между които и отпадни продукти при получаването на брендита и ракии или т.нар. винаса. Винасата е богата главно на захари и органични киселини и представлява един добър субстрат за биохимична конверсия и получаване на водород.
В настоящата дипломна работа беше направен опит да се отделят органичните киселини от захарите с оглед на по – благоприятното им усвояване на последните от микробиалната култура Clostridium butyricum.
За тази цел беше разработена йонообменна адсорбция на органични киселини върху анионообменна смола. В резултат на този процес контролиран посредством pH, органичните киселини бяха отстранени.
Беше наблюдавана известна неспецифична адсорбция на захари при процеса на йонния обмен, която е в рамките на около 10 %.
Clostridium butyricum култивиран върху тиогликолатна среда при строго анаеробни условия беше използван по – нататък в организиране на процес за получаване на биоводород.
Бяха изследвани процеси на периодично и полунепрекъснато генериране на биоводород при стайна температура. Както показват резултатите от изследванията на фиг. 7, процесът на развитие на Clostridium butyricum преминава първоначално през лаг фаза, продължаваща двадесет и пет часа. След това се наблюдава много бързо експоненциално нарастване на биомасата достигащо максимум при стотния час. По – нататък се установява лек спад и стациониране при около сто и тридесетия час. Отделянето на водорода започва от двадесет и петия час с постепенно нарастване до сто и петдестия час. Не беше отбелязано достигане на максимум или стациониране на процеса. Тази картина ни даде основание да се опитаме да направим полунепрекъснат процес чрез прибавяне на субстрат и съответно изваждане на продукт на определени интервали от време. Тези изследвания са показани на фиг. 9.
Прибавянето на субстрата и изваждането на продукта беше започнато на седемдесетия час на този експеримент, където се наблюдава известно стациониране на растежа на биомасата. При този полунепрекъснат процес беше демонстрирано едно сравнително задържане на растежа на биомасата и стациониране количеството на отделилия се водород. Тези данни показват, че организирането на непрекъснат процес е напълно възможно още повече, че никакъв лизис на биомасата не беше наблюдаван.
Изчерпването на субстрата (определяне на редуциращи захари) във хода на процеса е показано на фиг. 8. Графиката отразява постепенно изконсумиране на захарите съпроводено от повишаване на биомасата и увеличаване количеството на продуцирания водород.
При полунепрекъснатия процес бе установено известно стациониране на изменението на количеството на редуциращите вещества, както личи от графиката на фиг. 10.
Събирането на газа се извършваше под наситен разтвор на натриев хлорид в градуирани газхолдери. Отделеният газ беше анализиран с водороден сензор.
Въглеродния диоксид беше адсорбиран чрез 10 % разтвор на калциев хидрооксид.
Направените експерименти в настоящата дипломна работа показват, че изследвания субстрат винаса може успешно да бъде използван за получаване на биоводород посредством масленокисела ферментация.












И З В О Д И

В резултат на проведените опити за изследване на процеса на генериране на водород от винаса могат да бъдат направени следните по – важни изводи:

? Clostridium butyricum е култивиран на тиогликолатна среда при анаеробни условия и получената биомаса е използвана за получаване на биоводород.

? С помощта на анионообменна смола IRA – 400 са отстранени органични киселини от винаса, при което е наблюдавано изменение на pH на течната фаза от 4,0 до 7,0.

? Проведен е периодичен процес за получаване на водород, който е проследен в реактор с разбъркващо се устройство за 150 часа и е установено, че процеса протича с отделяне на водород със средна скорост 1,6 ml/h.

? Организиран е полунепрекъснат процес, при който е установено стациониране както на растежа на биомасата, така и на продуцирането на водород. Средната скорост на отделяне на газа е 2,18 ml/h.



ИЗПОЛЗВАНА ЛИТЕРАТУРА

Hall, D.; M. Adams; P. Gisby; K. Rao, New Scientist, 86, 72, (1980).

Benemman J.; Berenson J.; Kaplan N., M. Kamen, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 70, 2317, (1973).

Ochioi H; H. Shibada; J. Sawa; T. Katoh, Photochem. Photobiol., 35, 149, (1982).

Coguempot, M. F.; B. Thomasset, J.N. Barbotin, Europ. J. Appl. Microbiol. Biotechnol., 11, 193-198, (1981).

Kitajima, M. and W.L. Butler, Plant Physiol., 51, 746-750, (1976).

Karube, I; I. Mastsunaga; T. Otsuka; H. Kayano and S. Suzuki, B.B.A., 637, 400-405, (1980).

Gisby, P.E. and D.O. Hall , Nature, 287, 251-253, (1980).

Benemmаn. J. and N. M. Weare, Science, 184, 174-175, (1974).

Smith G. D., G. R. Lambert, Biotech. Bioeng. 23, 213-220, (1981).

10. N.Refssmessl, Hydrogen Energy for Tomorrow, (1997); http://www.eren.dol.gov/hydrogen/graphics/ADVTEC.pdf

Fedorov A.S., A.A. Tsygankov, K.K. Rao, D.O. Hall, Bitechnol. Lett. 20, 1007-1009, (1998).
Woodward, J. and M. Orr., Biotechnol. Prog., 14, 897-902, (1998).

Киров Н., Чомаков Х., Микробиология, Земиздат, София, (1991).

Влахов Ст., Иванов Ал., Обща микробиология, “Св. Климент Охридски”, София, (1996).

Suzuki S., I. Karube, T. Matsunava, Biotech. Bioenerg. Symp. 8, 501, (1978).

Suzuki S., I. Karube, S. Keyama, Ann. N.Y. Acad. Sci., 131, (1982).

Tanisho S., Kamiya N., N. Wakao, Bioelectrochem. Bioeng., 21, 25, (1989).

Taguchi, F, N. Mizukami, K. Yamada, K. Hasegawa and T. Saio-Taki, Enz. Microb. Technol., 17, 147, (1995).

Yokoi H., Tokushige T., Hirose J., Hayashi S., Takasaki Y., Biotechnol. Lett., 20, 143, (1998).

Ходжаоглу Ф., Получаване на водород с имобилизиран Clostridium butyricum, Дипломна работа, (2002).




Р Е З Ю М Е

Clostridium butyricum е бактерия, за която е известно, че при анаеробни условия и в присъствието на подходящ субстрат може да продуцира молекулен водород. При идеални условия на биохимична конверсия от 1 mol глюкоза могат да се получат 4 mol водород, което превръщане се извършва посредством мултиензимните системи на бактериите.
Както показват последните изседвания, водородът се очертава като гориво на бъдещето, поради това че при неговото изгаряне не се получават вредни емисии, а само вода.
Изследванията в катедра “Биотехнология” за получаване на водород с помощта на бактерии (от род Clostridia) са започнали преди две години с използване на различни субстрати, между които и отпадни продукти при получаването на брендита и ракии или т.нар. винаса. Винасата е богата главно на захари и органични киселини и представлява един добър субстрат за биохимична конверсия и получаване на водород.
В настоящата дипломна работа беше направен опит да се отделят органичните киселини от захарите с оглед на по – благоприятното им усвояване на последните от микробиалната култура Clostridium butyricum.
За тази цел беше разработена йонообменна адсорбция на органични киселини върху анионообменна смола. В резултат на този процес контролиран посредством pH, органичните киселини бяха отстранени.
Беше наблюдавана известна неспецифична адсорбция на захари при процеса на йонния обмен, която е в рамките на около 10 %.
Clostridium butyricum култивиран върху тиогликолатна среда при строго анаеробни условия беше използван по – нататък в организиране на процес за получаване на биоводород.
Бяха изследвани процеси на периодично и полунепрекъснато генериране на биоводород при стайна температура. Както показват резултатите от изследванията на фиг. 7, процесът на развитие на Clostridium butyricum преминава първоначално през лаг фаза, продължаваща двадесет и пет часа. След това се наблюдава много бързо експоненциално нарастване на биомасата достигащо максимум при стотния час. По – нататък се установява лек спад и стациониране при около сто и тридесетия час. Отделянето на водорода започва от двадесет и петия час с постепенно нарастване до сто и петдестия час. Не беше отбелязано достигане на максимум или стациониране на процеса.




Фиг. 7 Кинетика на получаване на биоводород и нарастване на биомасата


Тази картина ни даде основание да се опитаме да направим полунепрекъснат процес чрез прибавяне на субстрат и съответно изваждане на продукт на определени интервали от време. Тези изследвания са показани на фиг. 9.





Фиг. 9 Кинетика на получаване на биоводород и нарастване на биомасата



Прибавянето на субстрата и изваждането на продукта беше започнато на седемдесетия час на този експеримент, където се наблюдава известно стациониране на растежа на биомасата. При този полунепрекъснат процес беше демонстрирано едно сравнително задържане на растежа на биомасата и стациониране количеството на отделилия се водород. Тези данни показват, че организирането на непрекъснат процес е напълно възможно още повече, че никакъв лизис на биомасата не беше наблюдаван.
Изчерпването на субстрата (определяне на редуциращи захари) във хода на процеса е показано на фиг. 8.


Фиг. 8 Намаляване количеството на редуциращи вещества

Графиката отразява постепенно изконсумиране на захарите съпроводено от повишаване на биомасата и увеличаване количеството на продуцирания водород.

При полунепрекъснатия процес бе установено известно стациониране на изменението на количеството на редуциращите вещества, както личи от графиката на фиг. 10.

Фиг. 10 Изменение количеството на редуциращите вещества


Събирането на газа се извършваше под наситен разтвор на натриев хлорид в градуирани газхолдери. Отделеният газ беше анализиран с водороден сензор.
Въглеродния диоксид беше адсорбиран чрез 10 % разтвор на калциев хидрооксид.
Направените експерименти в настоящата дипломна работа показват, че изследвания субстрат винаса може успешно да бъде използван за получаване на биоводород посредством масленокисела ферментация.